Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran.
Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat.
Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi. Tahapan ini sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :
Rf = Jarak yang ditempuh substansi / Jarak yang ditempuh oleh pelarut
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.
Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning
Kromatogram
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.
Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis : Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.
Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis : Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.
CARA KERJA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
· Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus –OH.
· Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram
Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada:
• Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
• Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika.
Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
• Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
• Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika.
Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah Lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi kertas, untuk menyempurnakan pemisahan, lempeng dapat dibuat dengan campuran adsorben yaitu campuran homogen dari beberapa adsorben, satu lempeng dilapisi dengan adsorben yang berbeda-beda, satu lempeng dilapisi dengan campuran dua adsorben dengan konsentrasi bervariasi dari 0 % ke 100 % untuk adsorben yang satu dari ujung lempeng yang satu ke ujung lempeng yang lain dan sebaliknya, Area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents lebih banyak termasuk yang bersifat korosif dapat digunakan bila adsorben bukan selulosa.
Keburukan dari teknik ini mungkin hanya pada prosedur pembuatan lempengnya yang memerlukan tambahan waktu, kecuali bila telah tersedia lempeng yang diproduksi secara komersial.
Adapun manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yaitu :
· Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
· Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
· Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
· Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatrografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf :
· Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
· Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya.
· Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
· Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak
· Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan
· Teknik percobaan, Arah dalam mana pelarut bergerak di atas plat.
· Jumlah cupilkan yang digunakan, Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan.
· Suhu, Pemisahan-pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu tetap,
· Kesetimbangan, Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.
Prinsip pemisahan noda adalah berdasarkan kepolarannya sehingga menghasilkan kecepatan yang berbeda-beda saat terpartisi dan terjadilah pemisahan.Untuk memisahkan noda dengan sebaik-baiknya maka digunakan kombinasi eluen non polar dengan polar. Apabila noda yang diperoleh terlalu tinggi, maka kecepatannya dapat dikurangi dengan mengurangi kepolaran. Namun apabila nodanya lambat bergerak atau hanya ditempat, maka kepolaran dapat ditambah.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam KLT :
· Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu 1100C selama 30 menit.
· Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen.
· Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda berekor.
· Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.
· Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.
Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :
· Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat
· Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
· Lempeng yang tidak rata
Dalam KLT, fase diam harus mudah didapat. Keistimewaan KLT adalah lapisan tipis fase diam dan kemampuan pemisahnya.
Silika Gel, Pada umumnya sebagai fase diam digunakan silika gel. Untuk penggunaan dalam suatu tipe pemisahan perbedaan tidak hanya pada struktur, tetapi juga pori-porinya dan struktur lubangnya menjadi penting, di samping pemilihan fase gerak. Dalam perdagangan silika gel mempunyai ukuran 10-40µ. Ukuran ini terutama dipengaruhi oleh ukuran porinya yang bervariasi dari 20-50Å. Silika gel berpori 80-150 dinamakan berpori besar. Luas permukaan silika gel bervariasi dari 300-1000m2/g. Silika gel sangan higroskopis. Pada kelembapan relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Masalah aktivitasi silika gel tidak begitu mempengaruhi kebanyakan jenis pemisahan, tetapi deaktivitas silika gel merupakan hal yang perlu dipertimbangkan. Beberapa prosedur kromatografi terutama pemisahan yang menggunakan larutan pengembang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12% b/b. Derajat deaktivitasi ditentukan oleh kelembapan relatif kamar dimana pemisahan dilakukan dan lempeng silika gel disimpan.
Silika Gel, Pada umumnya sebagai fase diam digunakan silika gel. Untuk penggunaan dalam suatu tipe pemisahan perbedaan tidak hanya pada struktur, tetapi juga pori-porinya dan struktur lubangnya menjadi penting, di samping pemilihan fase gerak. Dalam perdagangan silika gel mempunyai ukuran 10-40µ. Ukuran ini terutama dipengaruhi oleh ukuran porinya yang bervariasi dari 20-50Å. Silika gel berpori 80-150 dinamakan berpori besar. Luas permukaan silika gel bervariasi dari 300-1000m2/g. Silika gel sangan higroskopis. Pada kelembapan relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Masalah aktivitasi silika gel tidak begitu mempengaruhi kebanyakan jenis pemisahan, tetapi deaktivitas silika gel merupakan hal yang perlu dipertimbangkan. Beberapa prosedur kromatografi terutama pemisahan yang menggunakan larutan pengembang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12% b/b. Derajat deaktivitasi ditentukan oleh kelembapan relatif kamar dimana pemisahan dilakukan dan lempeng silika gel disimpan.
Setelah silika gel,alumina merupakan fase diam yang paling banyak digunakan. Alumina termasuk kelompok fase dian dengan aktivitas tinggi. Alumina untuk KLT bersifat sedikit basa (pH 9), disamping itu ada juga alumina netral (pH 7) dan alumina asam (pH 4). Dalam banyak hal digunakan CaSO₄ sebagai pengikat. Pengikat ini dapat menurunkan kebebasan alumina sampai batas tertentu. Seperti silika gel, alumina terdapat dengan atau tanpa bahan pengikat dan juga denga indikator fluoresensi. Simbol yang digunakan untuk suatu produk tertentu sama dengan yang digunakan untuk silika gel (G, H, P, F). Sekarang alumina paling banyak digunakan untuk pemisahan senyaw yang kurang polar. Setelah deaktivitasi penuh, dapat digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofil kuat seperti gula atau asam amino.
Keiselguhr merupakan penyerap dengan aktivitas rendah. Tidak banyak digunakan dalam KLT. Penggunaan utama sebagai padatan pendukung untuk fase diam dalam kromatografi partisi.
Selulosa, Dengan digunakan selulosa untuk fase diam KLT, diperoleh mekanisme yang sama seperti kromatografi kertas. Perbedaan-perbedaannya terutama pada panjang serat, yang pada KLT panjang serat lebih pendek. Panjang serat bervariasi sari 2-20µ. Serat pendek menyebabkan difusi rendah selama pengembangan dan menghasilkan noda lebih kecil. Fakta ini memungkinkan pemisahan pada jarak lebih pendek daripada kromatografi kertas, juga waktu pemisahan lebih pendek. Tetapi dibandingkan dengan fase diam lain, misalnya fase diam anorganik, waktu yang diperlukan untuk suatu pemisahan lebih lama. Pada KLT selulosa digunakan untuk memisahkan senyawa hidrofil. Kriteria pemilihan pelarut pada kromatografi kertas padat diterapkan disini. Salah satu kelemahannya, tidak boleh menggunakan asam sulfat untuk menentukan letak noda.
Fase diam dapat dikelompokkan berdasarkan beberapa hal, misalnya berdasarkan sifat kimianya, dapat dikelompokkan dalam senyawa organik dan anorganik. Jika dilihat dari mekanisme pemisahan, fase diam dikelompokkan:
· Kromatografi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr)
· Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, slika gel)
· Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukar ion)
· Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)
Ada beberapa fase diam yang sulit dikelompokkan, misalnay poliamida, polimer organik berporiseperti Porapak. Setiap jenis fase diam sangat bervariasi, hal ini disebabkan oleh:
· Struktur fase diam
· Ukuran
· Kemurnian
· Zat tambahan sebagai pengikat dll.
Oleh karena itu data suatu publikasi tidak menjamin, walaupun semua cara percobaan telah dijelaskan tetapi spesifikasi fase diam tidak dinyatakan.
Pemilihan dari fase bergerak tergantung pada faktor-faktor yang sama seperti dalam pemisahan kromatografi kolom serapan. Sebaiknya menggunakan campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin karena mengurangi serapan dari setiap komponen dari campuran pelarut. Jika komonen-komponen yang mempunyai sifat polar yang tinggi (terutama air) dalam campuran cukup akan merubah sistem menjadi sistem partisi. Campuran yang baik memberikan fase-fase bergerak yang mempunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya dicegah sejauh mungkin mencampur lebih dari dua komponrn terutama karena campuran yang lebih kompleks cepat mengalami perubahan fase terhadap perubahan suhu. Kemurnian dari pelarut adalah lebih penting dalam KLT daripada bentuk-bentuk kromatografi lain, karena disini digunakan sejumlah materi yang sedikit. Sistem yang paling sederhana adalah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat dengan mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut ini adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimalkan fase gerak:
· Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
· Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
· Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga RF secara signifikan.
· Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuaran pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan elusi solut-solut yang bersifat basa dan asam.
Komentar
Posting Komentar